WB最后结果——膜上一片空白?

Release Time:2021-11-23

未出现阳性信号是抗体相关实验的常见问题,常出现的有WB实验曝光后膜上一片空白等现象,需要根据具体的情况进行分析:

一、确认检测靶点在样本中的表达情况

      一般来说,常见的蛋白可以在基因注释查询网站——BioGPS中进行查询。但应注意,该网站罗列的是基因对应编码蛋白在转录水平上的表达量。该表达量会与实际翻译产生的蛋白水平会有出入,仅能作为参考。低表达量的蛋白,在能检测到的情况下,可以提高抗体的稀释浓度来改善。

      分泌型蛋白在细胞的正常表达中,会分泌到细胞外,胞内残留的蛋白含量比较少,这种时候,建议用含有蛋白的阳性样本(比如组织)作为对照进行比对,判断是蛋白含量低还是抗体特异性的问题。

磷酸化蛋白,以及一部分蛋白,需要进行药物的刺激,才能在样本中高表达,这种情况下,一般客户可能没有阳性样本,需要客户提供参考文献作为说明,我们根据参考文献中的具体报道,进行问题的判明。有时候,客户会忽视文献中样本的处理步骤,导致反馈的产生。


二、样本制备的问题

      虽然很多时候,冻融过的样本可以进行重复,但是仍然有蛋白(例如小分子蛋白,分泌型蛋白等),在冻融之后会大量降解,使得先前可以做出来的结果,无法重复,这种时候,我们一般会建议客户进行新鲜样本 的制备和检测。

      在裂解细胞或者组织时,选择合适的裂解液也十分重要,常见的RIPA裂解液适用广泛,但是对于膜蛋白或者核蛋白,我们建议用专门提取此类蛋白的protocol进行样本制备,以达到目的蛋白的大量收集。


三、实验操作不当

      小分子蛋白极易降解,且吸附能力。转膜时应使用0.2μm的PVDF膜,并将甲醇浓度维持在20%,增强小分子蛋白在膜上的结合能力。转膜条件可设定为80v/1h,即使用较低的电压和适当的转膜时间。

      对于分子量约10kd左右的某些分泌型蛋白,这类蛋白在电泳时极易弥散,导致抗体无法检测,出现没有信号的情况,小分子蛋白的实验操作可以进行优化,条件如下:

      1. 配置SDS-PAGE胶时,加大浓缩胶的比例,使得浓缩胶:分离胶约为4:6,甚至可以5:5,这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分的浓缩,在后续的分离胶实验中,减少弥散程度。

      2. 电泳时,以80v电压进行压缩,时间约为40min,电泳至两种胶的界面。然后,将电压调整到100v,在12%-15%的分离胶中进行电泳,跑到分离胶一半的位置,一般10kd的marker能够分开就可以了,目的是避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。(这种时候可能内参就不好检测了,但是为了检测出小分子蛋白,还是跑另一块胶检测内参吧)

      3. 在转膜的时候,不要在转膜液中加入SDS,防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合,可以将甲醇的浓度提升至30%,增强小分子蛋白与膜的结合。

      4. 对于10kd左右的蛋白,转膜条件80v,30min就可以将蛋白转印,最多不超过60min,只要marker成功转移到膜上,相应的分子量就转移过去了。

      大分子蛋白在电泳时,使用6%-8%的分离胶,200kd以上建议6%进行分离,转膜时胶比较软,轻拿轻放。同时,需要降低甲醇的浓度,10%即可,为了防止蛋白在凝胶中形成沉淀,可以在转膜时加入终浓度0.1%的SDS,条件为80v,根据蛋白的大小,3h-5h,甚至更久的转膜时间都是可取的,对于200kd以上的蛋白,建议20v,在4℃转膜O/N,可以得到比较好的效果。

      封闭时,过长的封闭时间可能造成过度封闭使靶点结合抗体效率降低,洗膜也不宜过度,防止洗脱结合的蛋白。

      大包装抗体,或者长期储存的抗体,由于静置时间过久,甘油可能分层,浮在表面。在稀释抗体时,可能会造成吸不到抗体的情况,每次使用建议瞬时离心,将甘油离心到管底,吸取上层保存液使用,避免这种情况的发生。