曝光显出多个条带,是杂带吗?

Release Time:2021-11-23

“出现杂带”以及“条带位置不符合预期”,这两种情况需要分开讨论:

第一种情况:蛋白转录及翻译后的修饰,该因素是引起杂带的最常见原因。

转录后,由于选择性剪切的作用,同一个转录本会翻译出不同大小的蛋白,这类蛋白称为该蛋白的剪接体。

在UniProt查询蛋白时,可以在“Sequences”部分看到该蛋白已报道过的Isoforms。在进行实验前,需要比对每个剪接体造成的变化是否影响了目标蛋白的对应结构域,进而判断本研究种涉及的蛋白到底应该检测哪条主带,又或者哪几条带。

我们在阅读文献时所看到的WB实验图片中,也偶尔会出现双条带或多条带。这些现象是研究过程中值得解释和讨论的。在进行Western Blot实验时,我们应该清楚,针对某些目标蛋白的检测结果并不一定是只有一条带。

此外,蛋白在翻译完成后,可能会进行各类修饰,引起蛋白大小明显改变的多为糖基化修饰。在一些分泌型蛋白和膜蛋白上,糖基化位点的存在会将一个蛋白的大小增加至两倍或者更多,且由于组织的特异性,同一个蛋白在不同样本中的糖基化修饰差别很大(如下图所示)。

同时,有的蛋白存在前体和成熟体,这种蛋白一般客户在研究时,应该会有所了解,但为了防止信息差,依然需要跟客户解释这个蛋白本身的特性。

曝光显出多个条带,是杂带吗;蛋白大小跟报道的分子量不一致,是不是非特异带?

另一种情况比较偶发:在细胞的培养状态不太好或细胞传代过多的情况下,由于基因组的变异,细胞会表达某种蛋白的截短蛋白。这种被截短、剪接后的靶蛋白可能是未经报道,但由于仍存在抗原识别位点(或抗原表位)而被识别出来。一般情况下,可以通过裁膜避免。

还有一各影响因素,即蛋白等电点。

蛋白质本身是有电荷的,当处于某一个pH值时,蛋白质电荷会被中和,那么该处的数值我们称为等电点pI。大部分的蛋白质的等电点小于6,所以我们在中性的电泳环境中,蛋白因为等电点小于pH值,因此带负电荷,而电泳是蛋白从负极向正极迁移的过程,带负电的蛋白在电场中,不会受到阻力。但是有的蛋白等电点比较大,大于7甚至接近8,这时,由于电泳条件不足以中和电荷,使得蛋白质带正电,在电场中迁移受到阻力,由此产生蛋白分子量变大的错觉,因此marker仅能作为参考,而实际的主带仍然要结合蛋白特性进行判断。

样本保存和冻融。反复的冻融,或者蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂失效,会造成蛋白质的降解,引起多条带的情况出现,但这种情况一般是以“拖尾”的形式居多。另一种情况,大分子的蛋白本身会发生降解,但是由于观测的条带在比较大的marker附近,降解的较小片段在实际裁膜过程中,基本检测不到。同时,煮沸蛋白的时间不够,冻融后没有煮,会造成蛋白形成同源多聚体的形式,在目的大小两倍,或者多倍的地方出现条带。