FC实验步骤

一、细胞表面染色操作流程

1、细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清；

2、制备单细胞悬液：将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液；

3、(可选)阻断Fc受体：室温孵育10-20min；

4、一抗孵育：每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min；

5、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

6、二抗孵育：对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤8；

7、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。

二、细胞胞内染色操作流程

1、细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清；

2、制备单细胞悬液：将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液，400g离心5min去上清；

3、固定：每孔加入100μl细胞固定剂重悬细胞，2-8°孵育20min；

4、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

5、通透：每孔加入100μl细胞通透剂重悬细胞，室温孵育20min；

6、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

7、(可选）阻断Fc受体：10-20min；

8、一抗孵育：每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min；

9、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

10、二抗孵育：对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤11；

11、洗涤：400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍；

12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。