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ELISA实验中如何精确判断显色时长,TMB显色

2022-06-20
193次

监控OD620数据精确控制TMB显色法

原理:

TMB显色剂主要成分是二,二甲基联苯胺(非致癌HRP底物),氧化失去电子后变成电子转移复合物(TMB+TMB,复合物最大吸收峰652nm(蓝色),当加入酸性物质后导致电子转移复合物质子化,迫使两者分离出一分子的TMB(无色),一分子TMB+(黄色琨,最大吸收峰450nm),同时酸性条件下HRP酶失活,显色停止。

因此652的数据正向对应450的数据,(实验室使用620nm相对652误差10%)。

监控的OD620(蓝色)和终止后对照450表格

部分项目显色控制情况:

显色控制,精确计算注意事项:

1、酶标仪读取TMB+
450nm
的最佳设备分辨率是3.0以下,在2.2以下有非常好的线性(2倍关系)。如果是定量,显色不易过深,参考数据为Thermo FC酶标仪提供。注意:不同厂家的酶标仪灵敏度存在差异。

2、使用专业的曲线软件,推荐软件可以在菲恩网站下载(技术支持-下载),如果是抛物线建议使用四参数方程(MMF)计算。

3、显色过深后(OD4503.5),TMB+浓度较高,其溶解性大大低于TMB,会缓慢形成结晶并沉淀在孔底部(黑色针状颗粒),黄色会消退,应立即读数。过深的显色会在12小时后在孔底部出现大量黑色结晶,而无法保留黄色。


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